褪黑素對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

摘要: 目的 　 研究褪黑素(melatonin ,MT)對沙土鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。方法 　用沙土鼠雙側(cè)頸

總動脈結(jié)扎法建立全腦缺血再灌注損傷模型。用開場迷宮測試沙土鼠的定向運動活性的變化。用 T迷宮測試沙土

鼠的學(xué)習(xí)及工作記憶能力。光鏡下觀察缺血后 d 7海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 　缺血模型組沙土鼠

定向運動活性較假手術(shù)組顯著增高 ,學(xué)習(xí)及工作記憶能力降低。MT可降低沙土鼠的定向運動活性 ,提高沙土鼠的工

作記憶能力;還可顯著減輕海馬 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的病理改變 ,且作用呈劑量依賴性。結(jié)論 　 MT對沙土鼠全腦缺

血再灌注損傷有保護作用。

關(guān)鍵詞: 褪黑素; 腦缺血再灌注損傷; 定向運動活性; 工作記憶; 海馬 CA1區(qū)

　　腦缺血是臨床常見且預(yù)后較差的一種**。在

腦缺血的發(fā)病機制中 ,氧自由基引起的氧化損傷發(fā)

揮重要作用 ,抗氧化劑在腦缺血的**中有重要意

義。褪黑素(melatonin ,MT)是由松果體分泌的一種

神經(jīng)***** ,其生理功能主要為調(diào)節(jié)體內(nèi)的生

物節(jié)律、調(diào)節(jié)神經(jīng)***2**系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛及**催

眠等。近幾年 ,隨著對MT研究的深入 ,發(fā)現(xiàn)其有很

強的自由基**作用及抗氧化作用[1 ,2 ]

,且易通過血

腦屏障和細胞膜[3 ]

。因此 ,MT在腦缺血性損傷中的

作用受到廣泛關(guān)注。雖然MT對神經(jīng)保護作用已有

報道[4 ,5 ]

,但有關(guān)MT對腦缺血后神經(jīng)功能影響的研

究還很少。本工作著重從行為學(xué)和組織病理學(xué)相結(jié)

合的角度探討MT對沙土鼠全腦缺血再灌注損傷的

影響。材 料 與 方 法

藥品 　 褪黑素 ,Sigma 公司 ,用前溶于 5 %乙醇

生理鹽水。

實驗動物 　蒙古種沙土鼠 , ♀♂兼用 ,3 月齡 ,

體重 50～70 g ,由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

自由攝食水 ,每日8∶ 00～20∶ 00給予光照。腦缺血動物模型的制備 　 用沙土鼠雙側(cè)頸總動

脈阻斷法制備全腦缺血再灌注損傷模型[6 ]

。沙土鼠

用****鈉(45 mg· kg

- 1

,ip)麻醉后 ,作頸部正中

切口 ,分離兩側(cè)頸總動脈 ,用微動脈夾夾閉。以腦電

圖變?yōu)榛€為缺血模型成功的標志。缺血 10 min

后松開微動脈夾 ,恢復(fù)血液灌流。在實驗過程中 ,用

100瓦頭燈將動物肛溫控制在(3715 ±015) ℃,直至

動物蘇醒。

動物分組及給藥 　將 55 只沙土鼠隨機分成以

下5組( n = 11) : ①假手術(shù)(sham)組:手術(shù)操作同其

他組 ,但不夾閉雙側(cè)頸總動脈; ②溶劑(vehicle)組:

于缺血前 30 min ip 5 %乙醇生理鹽水 ,夾閉雙側(cè)頸

總動脈10 min 后復(fù)灌; ③MT 5 mg· kg

- 1

(MT5)組;④MT 10 mg· kg

- 1

(MT10) 組; ⑤MT 20 mg· kg

- 1

(MT20)組。MT現(xiàn)用現(xiàn)配 ,配時先溶解于無水乙醇 ,

再加生理鹽水稀釋 ,使乙醇終濃度為 5 %。③～ ⑤

組于缺血前30 min ip MT ,處理過程同vehicle 組。

開場迷宮測試 　 于術(shù)后 d 3和 d 7參照文獻[7 ,8 ]

方法進行開場迷宮(open field)測試 ,以評價動物的

定向運動活性P 習(xí)慣化。實驗在安靜、光線較暗的房

間內(nèi)進行。開場迷宮為 72 cm×76 cm×57 cm的木

箱 ,木箱底部漆成網(wǎng)格狀 ,均分為25個小格 ,每個小

格約為15 cm×15 cm。將沙土鼠放入迷宮中央 ,記

錄15 min內(nèi)沙土鼠在迷宮中爬行所經(jīng)過的格子數(shù) ,

以檢測動物的定向運動P 探究活性 ,評價動物的習(xí)慣

化。

T迷宮測試 　于術(shù)后 d 4 ,d 5 和 d 6 參照文獻[9 ,10 ]方法進行 T迷宮(T 2maze)測試。T迷宮外觀

呈 “T”形 ,由一個主干和兩個選擇臂構(gòu)成 ,主干長為

60 cm ,每個臂為30 cm長、 10 cm寬、 20 cm高。在兩

個選擇臂的末端各有1個食物杯 ,用來放食物(本實

驗所用的獎勵食物為向日葵籽) ,在選擇臂的近端有

一可抽拉的擋板。實驗在安靜的房間內(nèi)進行 ,環(huán)境

條件保持穩(wěn)定。在測試的前1 d進行1次訓(xùn)練 ,24 h

后進行測試。在測試時 ,**步先將迷宮的一個臂

擋住 ,只允許動物到達 T迷宮的另一個臂 ,在此動物

得到食物;在**步 ,將 T迷宮的兩臂都開放 ,但只

有原來被擋住的臂內(nèi)有食物 ,沙土鼠只有選擇進入

與**步方向相反的臂才能得到食物 ,記為 1 次正確 ,如沙土鼠重新進入**步實驗時去過的臂記作

1 次錯誤。如此兩步為一組 ,兩步實驗間隔15 s。每

只沙土鼠每天進行 10 組實驗 ,記錄其正確選擇次

數(shù)。為增加沙土鼠尋覓食物的動力 ,在進行測試之

前將沙土鼠禁食6 h。

海馬組織形態(tài)學(xué)觀察 　 術(shù)后 d 7 行為學(xué)實驗結(jié)

束后 ,動物用****鈉(45 mg· kg

- 1

, ip) 麻醉 ,開

胸 ,經(jīng)左心室先快速灌注生理鹽水 50 mL ,隨后灌注

含 4 %多聚甲醛的 011 mol· L - 1

磷酸鹽緩沖液(pH

714) 50 mL (10 mL· min

- 1

×5 min) 。取出全腦浸泡

于同一溶液中進行后固定 ,脫水后用石蠟包埋 ,自前

囟后117 mm處進行切片 ,厚度5μm ,用蘇木精2伊紅

(H2E)染色 ,在光鏡下放大 400 倍觀察海馬 CA1 區(qū)

錐體神經(jīng)元的病理改變?？梢杂^察到有明顯的細胞

膜、細胞核和核仁者為存活神經(jīng)元 ,核皺縮、核溶解

者視為壞死神經(jīng)元。缺血性神經(jīng)元損傷用 0～3 分

級[11 ]

:0 ,正常神經(jīng)元;1 ,少數(shù)神經(jīng)元死亡( < 25 %) ;

2 ,許多神經(jīng)元死亡(25 %～75 %) ;3 ,大部分神經(jīng)元

死亡( > 75 %) 。

統(tǒng)計學(xué)處理 　實驗數(shù)據(jù)用 € x ±s 表示 ,多個樣

本均數(shù)的比較用單因素方差分析 ,兩組之間的比較

用 Student2t 檢驗 ,神經(jīng)元損傷資料用等級序值法檢

驗[12 ]

。P < 0105為有顯著性差異。

結(jié) 果

1 　MT對腦缺血再灌注沙土鼠定向運動活性的影

響

在開場迷宮中 ,vehicle 組沙土鼠在測試中經(jīng)過

的格子數(shù)均較 sham組顯著增高( P < 0101) 。腦缺血

后d 3 ,MT組沙土鼠所經(jīng)過的格子數(shù)均低于 vehicle

組 ,其中MT10和MT20組與vehicle 組相比有顯著性差異( P < 0105或 P < 0101) 。腦缺血后 d 7 ,各組沙

土鼠定向運動活性均較 d 3降低 ,但MT組沙土鼠的

定向運動活性仍顯著低于 vehicle 組 ( P < 0105或

P < 0101) 。MT能夠降低腦缺血沙土鼠的定向運動

活性 ,且作用呈劑量依賴性(表1) 。

Table 1 　Effect of melatonin on locomotor activity in

open f ield test of ischemia2reperfusion injured

Mongolian gerbils ( n = 11 , … x ±s)

Group

DoseP

mg· kg - 1

Squares crossed

Day 3 Day 7

Sham - 265± 105　 229± 52　

Vehicle - 509± 144 3 3

443± 80 3 32 　MT對腦缺血再灌注沙土鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影

響

腦缺血再灌注后 d 4 ,d 5 和 d 6 ,vehicle 組沙土

鼠在 T迷宮測試中正確選擇次數(shù)均較 sham組顯著

降低( P < 0101) ,表明腦缺血沙土鼠的學(xué)習(xí)及工作

記憶能力顯著降低。MT組沙土鼠的正確選擇次數(shù)

均高于 vehicle 組 ,MT10和MT20 組與 vehicle 組之間

的差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P < 0105或 P < 0101 ,表2) 。