REM睡眠剝奪與恢復(fù)睡眠對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及皮質(zhì)nNOS**陽性細胞數(shù)目的影響

【摘要】　目的　探討快速眼動(REM)睡眠剝奪及恢復(fù)睡眠和**干預(yù)對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及皮質(zhì)神經(jīng)元型一氧化氮合酶

( nNOS)**陽性細胞數(shù)目的影響。方法　80只SD大鼠,隨機分為睡眠剝奪組( SD) 、空白對照組(CC) 、環(huán)境對照組( TC) 。其中

睡眠剝奪組包括睡眠剝奪1、3、5、7 d,恢復(fù)睡眠6、12、24和48 h 8個時點。用改良多平臺睡眠剝奪法進行REM睡眠剝奪,利用Y

迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、運用**組織化學(xué)觀測神經(jīng)元型一氧化氮合酶陽性細胞表達變化。結(jié)果　同空白對照組及環(huán)境對照

組比較,所有睡眠剝奪組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力均下降,而睡眠剝奪時間越長,學(xué)習(xí)記憶能力下降越明顯,皮質(zhì)nNOS陽性細胞數(shù)目越

多。隨睡眠恢復(fù)時間延長, nNOS陽性細胞數(shù)目逐漸減少,學(xué)習(xí)記憶能力提高。結(jié)論　REM睡眠剝奪能夠?qū)е聦W(xué)習(xí)記憶能力下降,

其機制與一氧化氮合酶增高分解產(chǎn)生的一氧化氮增多對神經(jīng)的毒性作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 　睡眠剝奪;睡眠;記憶;一氧化氮合酶

　睡眠剝奪是指由于某些原因?qū)е碌乃邤?shù)量減

少或睡眠質(zhì)量下降。睡眠剝奪對人體的影響十分明

顯:睡眠剝奪可以引起軀體疲勞、作業(yè)能力降低、**

功能下降、警覺水平降低,并引起情緒改變,精神不振、

粗心、注意力不能集中、食欲下降、記憶力下降、工作效

率降低等**反應(yīng)。長時間睡眠剝奪可引起實驗動物

死亡。本研究REM睡眠剝奪對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的

影響, 研究與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的一氧化氮合酶

(NOS)在REM睡眠剝奪不同時點的變化,同時通過迷

宮試驗測量不同時點睡眠剝奪后學(xué)習(xí)記憶能力的改1　材料與方法

1·1 　實驗動物　成年雄性Sp rague2Dawley大鼠80

只,重250～300 g,清潔級。由上海**醫(yī)科大學(xué)實驗

動物研究中心提供。

1·2 　實驗儀器　MG2Ⅱ型迷宮、H86 漩渦混合器、

TGL18臺式高速冷凍離心機、MP120電子天平、LXJ2Ⅱ

離心沉淀機、玻璃勻漿器、電熱恒溫水浴箱、Leitzl400

切片機、HP IAS21000圖像測量分析系統(tǒng)等。

1·3　**與試劑　Rabbit Anti2NOS1、即用型SABC

**組化染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒(博士德生物

工程有限公司) 。

中國醫(yī)師雜志 　2007年 1月 　第 9卷第 1期 1

3 基1·4　動物分組及喂養(yǎng)　本實驗于2002年8月在長

征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室進行。先將大鼠進行“Y”迷

宮[ 1, 2 ]訓(xùn)練4～7 d,取達到標(biāo)準(zhǔn)(具體標(biāo)準(zhǔn)見后)的大

鼠,將大鼠隨機分為2組,分別為睡眠剝奪組( SD組,

n = 40)和對照組( n = 40) 。睡眠剝奪組包括睡眠剝

奪1、3、5、7 d、睡眠剝奪7 d后恢復(fù)睡眠6、12、24、48 h

八個時點,每個時點5只大鼠。分別編號、稱重,對照

組分為空白對照組(CC, n = 20)和環(huán)境對照組( TC, n

= 20) 。

1·5　睡眠剝奪模型的建立　采用改良多平臺睡眠剝

奪法(MMPM)建立REM睡眠剝奪模型。制作長110cm、寬60 cm、高40 cm的水槽,其中放置15個直徑為

615 cm,高810 cm的平臺,平臺間間隔15 cm,在平臺

周邊注滿水,水溫保持在22℃左右,水面距平臺面約

110 cm,大鼠在平臺上可自行飲食飲水,并可在平臺間

活動。當(dāng)大鼠進入REM睡眠時,由于全身肌肉張力降

低,節(jié)律性地垂頭觸水而覺醒,從而使動物始終不能進

入REM睡眠。實驗在神經(jīng)內(nèi)科動物睡眠研究實驗室

進行,室內(nèi)溫度控制在2210～2410℃, 40 W日光燈照

射08: 30～20: 30。實驗前將各組大鼠放在同1籠中飼

養(yǎng)2周,實驗前1周將大鼠放在平臺上適應(yīng),每天適應(yīng)

1 h。睡眠剝奪從08: 00開始,睡眠剝奪期間燈光持續(xù)

照射,水糟中的水每天更換。TC組采用與SD組大小

一樣的鼠箱,但在其底部并不放置平臺,而是放置一面

細密鐵絲網(wǎng),把大鼠放在網(wǎng)上,網(wǎng)下置水至離網(wǎng)格1

cm,以形成與SD組相似的環(huán)境。其它條件均與SD組

相同。CC組為放在一起飼養(yǎng)2周,未進行任何處理的

大鼠,飼養(yǎng)條件與SD組、TC組均相同。1·6　取材　各組動物在相應(yīng)時點處死,用于**組

化的實驗動物先予以10%水合氯醛( 30 mg/kg)腹腔

內(nèi)注射麻醉,開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管,先以100

ml生理鹽水沖洗血液,隨后用冷的(4℃)含4%多聚甲

醛的011 mol/L磷酸鹽緩沖液( PB, pH 714)先快后慢

灌流固定。2 h后取腦置于30%蔗糖中。

1·7　認(rèn)知功能測試?、?/span>MG22型“Y”迷宮設(shè)置參數(shù)

電刺激參數(shù)是:電壓50～70 V,延時2～5 s。⑵測試指

標(biāo)　正誤判定的標(biāo)準(zhǔn):大鼠在足底通電后10 s內(nèi)一次

性跑向**區(qū)為正確反應(yīng),否則為錯誤反應(yīng),向所在的

起步區(qū)逆向逃竄也應(yīng)歸為“錯誤反應(yīng)”; 錯誤次數(shù)

(EN) :系每天訓(xùn)練中出現(xiàn)錯誤反應(yīng)的次數(shù),一般訓(xùn)練

20次/d,該指標(biāo)反映大鼠反應(yīng)的正確程度;全天總反

應(yīng)時間( TRT) :動物的反應(yīng)時間(潛伏期)指從信號燈

亮開始至大鼠第1次逃至燈亮區(qū)為止所耗的時間,全

天總反應(yīng)時是一個實驗日(全天)完成所有反應(yīng)(包括正確反應(yīng)和錯誤反應(yīng))所需時間,該指標(biāo)反映大鼠反應(yīng)

時間的長短,可綜合評價大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。⑶訓(xùn)

練方法　采用隨機休息法,**區(qū)以無規(guī)則次序變換,

以訓(xùn)練大鼠辨別燈光刺激及**方位的能力。以大鼠

所在支臂就作為測試的起點,大鼠受電擊后逃到**

區(qū)后,燈光繼續(xù)作用10～15 s,熄燈后結(jié)束一次測試,

兩次測試時間間隔為30 s或休息1 min后、再予以第2

次測試,依次重復(fù)。固定訓(xùn)練20次/d,連續(xù)訓(xùn)練3～4

d。⑷認(rèn)知功能障礙的標(biāo)準(zhǔn)及計算　規(guī)定大鼠受電擊

后從起步區(qū)直接逃至**區(qū)為“正確反應(yīng)”,大鼠學(xué)習(xí)

記憶成績以其測試達到連續(xù)10次中有9次(9 /10)正

確反應(yīng)時所需的電擊次數(shù)表示。達9 /10正確反應(yīng)標(biāo)

準(zhǔn)所需電擊次數(shù)多少表示大鼠認(rèn)知功能的優(yōu)劣。

1·8　**組化染色　運用ABC法,蘇木素輕度復(fù)

染,脫水,透明,封片,顯微鏡觀察。

1·9　定量分析計數(shù)　分別選擇3個相鄰視野,在40

倍光鏡下采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格對**反應(yīng)陽性產(chǎn)物進行計

數(shù),以“個/mm2 ”為單位,取3個視野的平均值。以陽

性細胞數(shù)除以相應(yīng)的面積,得出陽性反應(yīng)細胞的面積

密度(NA) ,每個標(biāo)本取3張切片的均值供分析。

1·10　統(tǒng)計學(xué)處理　用SPSS軟件,計數(shù)資料用.x ±s表示,差異顯著性檢驗用t檢驗分析。

2　結(jié)果

2·1　睡眠剝奪后大鼠行為和生理變化[ 3 ] 　睡眠剝奪

7 d行為的變化尤其明顯,表現(xiàn)為大鼠興奮性提高,探

究行為和攻擊性增強,對環(huán)境刺激的警覺性、反應(yīng)性及

進攻行為也增強。睡眠剝奪7d生理改變明顯,大鼠飲

食量增加、能量消耗增加、體重下降。表現(xiàn)疲憊不堪、

皮毛蓬亂、無光澤,尾巴和爪子的底表面也有損害。在

預(yù)實驗中觀察到睡眠剝奪7 d以后有個別大鼠死亡。

睡眠剝奪7 d后恢復(fù)睡眠12 h上述表現(xiàn)大多消失,所

有大鼠均出現(xiàn)睡眠增加。

2·2　學(xué)習(xí)記憶測定　睡眠剝奪前各組學(xué)習(xí)記憶能力

基本一致( P > 0105) 。正常對照組和環(huán)境對照組自

始至終均未出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙,而睡眠剝奪組隨剝奪

時間的增加,所需電擊次數(shù)較對照組明顯增加( P <

0101) ,出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙,隨睡眠剝奪后恢復(fù)時間延

長,學(xué)習(xí)記憶能力提高。見表1。2·3　**組化染色　各組切片經(jīng)nNOS**組織化

學(xué)染色后, nNOS**陽性細胞呈棕黃色。與對照組比

較, REM睡眠剝奪組大鼠皮質(zhì)nNOS**陽性細胞均

明顯增多,各組皮質(zhì)nNOS陽性細胞的NA。REM睡眠

剝奪組的NA顯著高于環(huán)境對照組和空白對照組( P

< 0101)見表1。表1　大鼠Y型迷宮學(xué)習(xí)記憶成績及皮質(zhì)nNOS**

陽性細胞NA值　　( .x ±s )

　組別例數(shù)電擊次數(shù)　　皮質(zhì)NA值　　

　空白對照組20 　　12. 65 ±2. 37 　　　25. 6 ±4. 5

　環(huán)境對照組20 　　12. 67 ±2. 17 　　　28. 5 ±3. 4

　睡眠剝奪1d 5 　　20. 15 ±4. 10 　　　39. 6 ±2. 8▲

　睡眠剝奪3d 5 　　29. 68 ±5. 34▲ 　　　45. 7 ±3. 2▲

　睡眠剝奪5d 5 　　49. 31 ±5. 23▲▲ 　　　54. 3 ±1. 8▲▲

　睡眠剝奪7d 5 　　56. 67 ±4. 66▲▲ 　　　57. 9 ±3. 6▲▲

　睡眠剝奪恢復(fù)6h 5 　　45. 88 ±6. 47▲ 　　　53. 2 ±3. 8▲▲

　睡眠剝奪恢復(fù)12h 5 　　36. 53 ±3. 18▲ 　　　45. 4 ±4. 1

　睡眠剝奪恢復(fù)24h 5 　　20. 85 ±6. 44 　　　32. 3 ±3. 6

　睡眠剝奪恢復(fù)48h 5 　　18. 57 ±3. 20 　　　25. 1 ±2. 3

　　注:與對照組比較▲P < 0105; ▲▲P < 0101

3　討論

睡眠是機體的正常生理需要,睡眠一旦被剝奪,則

會對機體產(chǎn)生相應(yīng)的生理和心理影響,并會導(dǎo)致行為

失常以及**的發(fā)生。睡眠能增強大鼠的學(xué)習(xí)能力,

對于學(xué)習(xí)復(fù)雜事物的鞏固化也是非常必要的。睡眠

時,一種細胞激活素的基因在大腦中活性提高,能改善

突觸傳遞,增強對獲取的信息進行處理和加工、形成記

憶的能力。研究發(fā)現(xiàn),在整個睡眠階段中, REM睡眠

對學(xué)習(xí)和記憶的影響更大[ 4 ] 。在學(xué)習(xí)較復(fù)雜的知識或

完成較多的任務(wù)后, REM睡眠數(shù)量增加比較明顯;而

在完成簡單任務(wù)或?qū)W習(xí)簡單知識后, REM睡眠數(shù)量增

加并不多。探索學(xué)習(xí)記憶的原理與規(guī)律可以闡明以學(xué)

習(xí)記憶障礙為表現(xiàn)的睡眠障礙的機制和尋找其有效防

治的手段[ 5 ] 。一氧化氮(NO)作為**神經(jīng)系統(tǒng)細胞間信使分子[ 6 ] , 在學(xué)習(xí)記憶機制中具有重要作用。

NOS是催化產(chǎn)生內(nèi)源性NO的**酶類,NO作為神經(jīng)

系統(tǒng)全新的信號物質(zhì),以其獨特的逆行信使作用參與

了與突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的長時程增強(LTP)

機制[ 7, 8 ] 。NOS抑制劑可以阻斷LTP,表明NO為LTP

形成所必需?，F(xiàn)已明確NO作為逆行信使介導(dǎo)LTP的

通路和機制。NO在突觸后產(chǎn)生并彌散出神經(jīng)元,逆向

運行至突觸前以及周圍相關(guān)神經(jīng)元,透過細胞膜活化

鳥氨酸環(huán)化酶,使cGMP水平升高,促進神經(jīng)遞質(zhì)(如

谷氨酸等) 釋放, 谷氨酸作用于突觸后NMDA 及非

NMDA受體,鈣離子內(nèi)流流入突觸后,與鈣鎂一起激活

NOS,又產(chǎn)生NO,從而誘導(dǎo)和維持LTP過程。NO是近

年來被認(rèn)識的一種特殊神經(jīng)遞質(zhì),它既是學(xué)習(xí)記憶過

程的關(guān)鍵信號,又能產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)損傷。NO與海馬

長時程增強的形成有關(guān)[ 9 ] 。NO是由L2精氨酸和分子

氧在3種不同的一氧化氮合酶催化下生成的。根據(jù)酶的細胞或組織來源不同,將其分為3型:神經(jīng)元型NOS

( nNOS,NOS21) 、**型NOS ( iNOS, NOS22)和內(nèi)皮細

胞型NOS ( ecNOS, NOS23 ) ,從功能上講, nNOS和ec2

NOS屬于原生型( cNOS) , iNOS屬于誘導(dǎo)型( iNOS) 。

目前公認(rèn), ecNOS 產(chǎn)生的NO 有神經(jīng)保護作用, 而

nNOS和iNOS產(chǎn)生的NO則有神經(jīng)毒性作用。

本實驗發(fā)現(xiàn),同對照組比較,所有睡眠剝奪大鼠學(xué)

習(xí)成績均下降,隨睡眠剝奪時間越長,大鼠學(xué)習(xí)能力下

降越明顯。睡眠剝奪時間延長,導(dǎo)致神經(jīng)元型一氧化

氮陽性細胞數(shù)明顯增多,催化產(chǎn)生高濃度的NO,高濃

度NO具神經(jīng)毒性作用表現(xiàn)在它能誘發(fā)氧化應(yīng)激,抑

制線粒體功能,干擾能量代謝,損傷DNA或?qū)е?/span>DNA

突變,使胞液Ca2 +升高,激活大量途徑損害細胞,誘導(dǎo)

細胞凋亡[ 10 ] 。過高的NOS也具有神經(jīng)毒性作用。本

實驗表明,睡眠剝奪組與睡眠剝奪后恢復(fù)睡眠組比較,

睡眠恢復(fù)可以改善學(xué)習(xí)記憶能力,減少電擊次數(shù),降低

神經(jīng)元型一氧化氮合酶陽性細胞數(shù)。證明及時恢復(fù)睡

眠可以防止睡眠剝奪后的學(xué)習(xí)記憶損害,其機制可能

與改善細胞內(nèi)的代謝紊亂,從而改善學(xué)習(xí)記憶障礙。

本實驗也顯示,睡眠恢復(fù)并不能完全抑制睡眠剝奪所

致的神經(jīng)元性一氧化氮合酶陽性細胞增多和阻止LTP

損害,說明睡眠剝奪后的學(xué)習(xí)記憶障礙的機制十分復(fù)

雜,并不是單一機制發(fā)揮作用。對于睡眠剝奪對學(xué)習(xí)

記憶及腦神經(jīng)功能的研究有待于進一步深入。